通过乳腺癌 MCF-7细胞系建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型 CYB5D2 对乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠肿瘤生长的影响
发布时间：
2022-06-06
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摘要∶
CYB5D2蛋白是一种神经营养因子，可通过抑制细胞增殖促进神经元分化，随着研究深入，有学者发现1-司CYB5D2 还参与乳腺癌、宫颈癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发生及进展，是多种肿瘤的候选抑癌因子。上皮细胞间质转化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）是恶性肿瘤发生及发展过程中的重要病理机制，EMT过程中，上皮细胞极性丧失，同时获得浸润性与迁移能力团。
为研究 CYB5D2是否通过EMT来调控乳腺癌的发生及发展，笔者建立 20 只乳腺癌皮下转移瘤动物模型大鼠，通过分析不同处理组大鼠转移瘤组织内 EMT相关蛋白质表达情况，探究CYB5D2 在乳腺癌中作用机制。
目的：
研究CYB5D2对乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠肿瘤生长的影响。
方法：
通过乳腺癌 MCF-7细胞系建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。将含有CYB5D2 表达的质粒稳定转染 MCF-7细胞，多点注射，将稳定转染的细胞注入裸鼠皮下，作为观察组，同时设置 shRNA-CYB5D2阴性质粒为阴性对照组，PBS为空白对照组。测量各组大鼠肿瘤体积及质量;裸鼠转移瘤模型建立成功后处死小鼠，qRT-CPR 法检测肿瘤组织内CYB5D2 mRNA 表达水平;Western Blot 法检测各组裸鼠转移瘤组织内上皮细胞间质转化（EMT）标志表白表达情况，酶联免疫吸附法检测裸鼠转移瘤细胞上清液中MMP-2及 MMP-9水平。
结果：
观察组转移瘤平均体积及质量显著低于阴性组与空白组（P<0.05），阴性组与空白组裸鼠转移瘤体积及质量无明显差异（P>0.05）。提取试验小鼠肿瘤组织总 RNA，qRT-CPR 法检测提示观察组肿瘤组织内CYB5D2 mRNA表达量显著高于阴性组及空白对照组（P<0.05），而阴性组与空白组间差异无显著性差异（P>0.05）;Western Blot 法检测结果显示，观察组转移瘤组织内E-cadherin、β-catenin 蛋白表达水平显著高于与阴性组及空白组（P<0.05），而N-cadherin 及 Snail蛋白表达显著低于与阴性组及空白组（P<0.05）。阴性组与空白组转移瘤组织内E-cadherin、β-catenin、N-cadherin及 Snail 蛋白表达无显著性差异（P>0.05）;观察组裸鼠转移瘤细胞上清液中 MMP-2及 MMP-9水平显著低于与阴性组及空白组（P<0.05）），而阴性组与对照组 MMP-2 及 MMP-9水平无显著性差异（P>0.05。
结论：
上调CYB5D2基因可有效抑制乳腺癌皮下移植模型大鼠瘤体生长，推测上调CYB5D2基因可能通过下调N-cadherin、Snail、MMP2及 MMP9，上调E-cadherin、β-catenin，逆转 EMT，发挥抗肿瘤功效。
关键词∶
CYB5D2;乳腺癌;皮下移植瘤大鼠动物模型;肿瘤生长
讨论：
乳腺癌已成为女性群体中发病率最高的恶性病变，严重威胁女性生命健康。探究乳腺癌病因，寻找有效的治疗方法一直是临床研究的住点。本文通过小鼠肩胛皮下组织注射乳腺癌 MCF-7细胞，建立乳腺癌皮下转移瘤模型大鼠，并在体外构建 CYB5D2 基因稳定转染上调的 MCF-7细胞与稳定转染下调的 MCF-7 细胞;分别注射至乳腺癌皮下转移痛模型大做皮下组织，并设置为观察组、阴性组及空白组（注射空白质粒转染的 MCF-7细胞）。注射完毕后第5d开始测量模型大鼠转移瘤体积及重量，结果发现，与阴性组及空白组相比，注射 CYB5D2基因稳定转染上调 MCF-7细胞的观察组大鼠转移瘤体积及重量明显减轻，提示 CYB5D2基因表达上调可有效抑制乳腺癌肿瘤的生长。
EMIT是上皮源恶性肿痛发生侵袭转移的预程序，经历 EMIT 反应的肿瘤细胞，其上皮性表性标志蛋白包括E-cdherin、B-catenin、Cladin 等表达水平将明显下降，与此同时，间质性表型蛋白如 N-cadherin、Vimentin 等表达水平上升-0。其中E-cadherin是肿瘤细胞 EMTT进程中的关键蛋白，E一cadherin 蛋白在浸润性癌细胞系中的重新表达可有效降低浸润性细胞体外侵袭能力以。B-catenin 则可直接与E-cadherin 结合为复合物，保障细胞间紧密相连，同时，β-catenin 还是 Wnt 信号通路的核心蛋白，可激活Wnt 途径，诱导 EMIT转录因子 Snail、Twit 等表达产物四。其中 Snal是一种含锌指结构的DNA结合蛋白，具有抑制E-cadheri蛋白启动子活性的生物功能，诱导EMT发生贝。检测组织细胞EMT相关蛋白表达情况，可有效判断其EMT状况，推测目的基因在乳腺癌发生及发展中的作用
本文研究发现，观察组乳腺癌转移瘤瘤体细胞内E-cadherin、β-calenin蛋白表达水平显著高于与阴性组及空白组，而N-cadherin及Snail蛋白表达显著低于与阴性组及空白组。提示上调CYB5D2 基因可能上调E-cadberin、β-catenin蛋白，下调N -cadherin及Snail蛋白，进而抑制乳腺癌裸鼠皮下转移瘤的生长。
此外，金属基质蛋白酶家族（MMPs）是肿瘤侵润及转移的敏感标志物，其可重塑肿瘤微环境，并诱导大量血管生长，进而促进肿瘤浸润及转移D-四. MMP-2及MMP-9是MMPs中最重要的两个成员。有研究显示叫，MMP9与卵巢癌组织中呈高表达状态，且与Snail呈正相关，与E-cadherin呈负相关。Liu D等研究发现，MMP2可通过EMT途径促使肝癌侵袭及转移。总而言之，MMP2及MMP9 在恶性肿瘤侵袭及转移中具有重要意义。本文研究发现，观察组试验大鼠移植瘤组织细胞内MMP2及MMP9浓度均显著低于阴性组及对照组，提示上调CYB5D2基因可有效减轻乳腺癌组织内MMP2及MMP表达，推测上调CYB5D2基因可抑制乳腺癌细胞侵袭及转移。
结论：
上调CYB5D2基因可有效抑制乳腺癌皮下移植模型大鼠瘤体生长，推测上调CYB5D2 基因可能通过下调 N-cadherin、Snail、MMP2及 MMP9，上调 E -cadherin、β-catenin，逆转 EMT，发挥抗肿瘤功效。
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