通过网络药理学和动物实验，初步探究红曲治疗脑小血管病（CSVD）的作用机制
发布时间：
2022-05-23
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摘要∶
脑小血管病（CSVD）是直径介于40～200 μm 的脑血管病变引起的综合征"1，临床表现为脑白质病变、脑微出血、腔隙性梗死等。研究表明，CSVD与痴呆、卒中等疾病关系密切，约有45%的血管性痴呆和20%的缺血性卒中由 CSVD引起。西医治疗CSVD主要通过溶栓药、降压药、抗血小板等早期干预，效果不佳且不良反应较大。中医理论认为CSVD属"络病"范畴，治法为扶正祛邪，中药治络病效果显著，不良反应较少，已成为近年来的研究热点。
红曲（red yeast rice，HQ）为药食两用中药，生产历史悠久，药用记载始干《饮膳正要》。2020年版《中国药典》5记载红曲为紫色红曲霉Monascus purpureus Went 寄生于粳米发酵而得。其味甘，性温，无毒、归肝、脾经，有活血化瘀、通经活络功效。现代药理研究表明，红曲成分中Monacolin K及其衍生物、红曲色素、y-氨基丁酸等具有显著的降血脂、降血压、神经保护、改善微循环等作用，提示红曲可作为治疗 CSVD的潜在药物。
网络药理学是基于生物信息学、药理学等的综合性学科，通过构建生物分子互作网络，系统化诠释分子作用机制。因此，本研究基于网络药理学研究方法构建红曲"药物-成分-靶点"网络，获取相关成分、靶点、通路信息，通过动物实验对网络药理学结果进行验证，探讨红曲治疗CSVD的物质基础和分子机制。
目的
通过网络药理学和动物实验，初步探究红曲治疗脑小血管病（CSVD）的作用机制。
方法
通过 PubChem、SwissTargetPrediction等数据库获取红曲成分及作用靶点，运用GeneCards、OMIM等数据库获取 CSVD的疾病靶点，结合Cytoscape 3.7.1软件构建"药物-成分-靶点"网络;取交集靶点输入STRING 11.0数据库，构建PPI网络;利用DAVID6.8数据库进行GO和KEGG分析。建立大鼠CSVD动物模型，通过Morris 水迷宫、HE染色、ELISA、Western blot等验证网络药理学分析结果。
结果
筛选出43个活性成分，37个关键靶点，GO 分析结果涉及神经炎症、细胞增殖等，KEGG结果涉及 PI3K-Akt和RAS信号通路等;动物实验结果显示，红曲干预后可显著改善CSVD大鼠海马CA1区损伤，降低血清中IL-6、IL-1βB、TNF-α炎症因子水平，上调 PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达。
结论
本研究结合动物实验对网络药理学预测结果进行验证，发现红曲可能通过调控 PI3K/AKT/mTOR通路改善CSVD模型大鼠的症状，为红曲的临床应用提供依据。
关键词∶
动物实验;网络药理学;红曲;脑小血管病;分子机制
讨论：
CSVD是临床常见的脑血管疾病，与高血脂、高血压等危险因素关系密切。中医理论尚未明确定义CSVD、通常认为其属于络病，病位在脑，由浊邪入血，入髓伤髓所致。临床治疗CSVD应以活血化瘀、化浊益髓的中药为主1。红曲具有活血化瘀、健脾消食的功效，临床上常用的中成药血脂康、脂必妥均以红曲为主要成分，广泛用于治疗高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管病等，可作为治疗CSVD的潜在药物。
本研究运用网络药理学方法筛选获得Monacolin K、Ankaflavin、GABA等43个红曲 活性成分，PIK3CA、MTOR、MAPK1等1126个脑小血管病靶点;PPI网络分析共发现91个节点，752条边，平均Degree值为16.7、获得EGFR、MAPK1、ESR1等37个关键靶点;GO分析结果涉及171个生物过程、33个细胞组分、51个分子功能，主要涉及神经炎症、信号转导、细胞增殖等。研究表明，神经炎症在脑血管疾病的发展中起重要作用，降低相关炎症因子如TNFα、IL-6、IL-1β等水平，可改善血脑屏障通透性，减轻脑组织损伤促使大脑结构功能恢复正常。KEGG分析结果得到104个通路.主要有PI3K-Akt、Rapl、RAS 通路等.P3K-Akt通路研究较为广泛，其在脑卒中、血管性痴呆等疾病的治疗中起着重要作用。Qi等研究发现3-丁基苯酞（NBP）能通过激活 PE3K/Akt信号通路抑制CSVD大鼠神经细胞凋亡，恢复细胞基本功能，提高大鼠学习记忆能力。Cha等1研究表明人参皂苷Rg，可通过 PI3K/Akt mTOR 信号通路增加缺血性卒中后血管内皮生长因子的表达，促进脑内血管生成，改善脑血流量。
本研究选择不同剂量红曲干预CSVD模型大鼠，探究其作用机制，对网络药理学研究结果进行验证。Morris水迷宫实验结果显示，红曲能显著缩短CSVD大鼠的逃避潜伏期，增加穿越平台次数. 表明红曲显著改善CSVD模型大鼠的短期学习记忆能力;HE病理切片结果显示红曲治疗组大鼠海马CAl区细胞形态完整、排列整齐，核仁和胞浆界限清晰，不同剂量红曲治疗组海马 CA1区病变程度均有明显改善，高、中剂量效果较为明显;网络药理学GO分析结果表明，红曲治疗CSVD可能与神经炎症、细胞增殖、信号较导等生物过程相关，其中神经炎症在CSVD发展过程起重要作用。生化指标结果显示∶不同剂量红曲治疗组可显著降低CSVD模型大鼠血清 TNFa、IL-6、IL-1β炎症因子水平。其效果呈剂量依赖性;网络药理学研究结果显示红曲中 Moracolin类、红曲色素等为其活性成分，本研究结果中红曲能显著降低TNF-a、ⅡL-6、IL-1水平可能与上述成分有关。KEGG分析结果显示.涉及CSVD的有PI3K-Akt、RAS、Rapl信号通路等。研究表明 PI3K-Akt信号通路可通过调节下游把蛋白mTOR活性。参与自噬清除β淀粉样蛋白的沉积、恢复细胞功能等发挥神经保护作用12-1网;Western blot结果表明.与假手术组相比.模型组PI3K、AKT、mTOR蛋白水平显著降低∶ 与模型组相比.红曲治疗组可不同程度增加 PI3K、AKT、mTOR蛋白水平.提示红曲可通过上调 PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达.参与调控神经元细胞增殖、分化、凋亡等发挥治疗CSVD的作用。
综上，通过网络药理学和分子对接，构建红曲治疗CSVD的成分、疾病、作用靶点、相关通路之间的复杂网络关系，展现了中药多成分、多靶点、多途径的治疗优势。通过Morris水迷宫，海马组织HE染色.TNF-a、IL6、IL-1β炎症因子检测，PB3K、AKT、mTOR蛋白测定等实验验证网络药理学预测结果.初步揭示了红曲治疗 CSVD的药效机制，可为后期深入探究其治疗CSVD机制提供理论依据。
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