临床前研究胰腺神经内分泌肿瘤的最新突破性的进展
发布时间：
2022-05-13
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【摘要】胰腺神经内分泌肿瘤（pNEN）是相对罕见的胰岛细胞起源的肿瘤，在组织病理学、生物学行为、临床表现等方面异质性显著。近年来，研究的推广和认识的加深推动着国内外专家共识、临床指南的快速更新。然而，pNEN发病率低、异质性高的特点使其临床前研究工作在肿瘤学领域处于相对落后地位。多中心、跨区域乃至国际化合作既是保证研究罕见病样本量的重要模式，也为对比分析不同遗传背景pNEN的特征搭建平台。随着研究数据的快速积累，逐级细化研究亚型将有助于系统、全面地认识pNEN的群体异质性。此外，利用单细胞测序等前沿技术手段从细胞水平阐述 pNEN的个体异质性可能会带来突破性的进展。
【关键词】胰腺神经内分泌肿瘤;分子特征;疾病模型;临床前研究
胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrine neo-plasm，pNEN）是起源于胰岛内分泌细胞的上皮性肿瘤，相对罕见占胰腺肿瘤的比例<5%。PNEN分布具有明显地区差异∶在美国、英国等欧美地区，pNEN较小肠和直肠内分泌肿瘤少见;而在中国、印度等亚洲地区，pNEN是最常见的消化系统内分泌肿瘤"】。随着临床医生对该疾病认识的加深以及影像学等诊断技术的进步，pNEN发病率在全球范围内均明显上升，这可能主要归因于体积小、无症状肿瘤的检出率增加。
高度异质性是 pNEN最鲜明的特征∶根据是否来源于家族性综合征，分为散发性和遗传相关性;根据肿瘤细胞分化，分为胰腺神经内分泌瘤（pancreatic neuroendocrine tu-mor，pNET）和神经内分泌癌（pancreatic neuroendocrine car-cinoma，pNEC），前者则依据增殖指数再分为G1、G2、G3级;根据是否出现激素过量分泌导致的相关临床表现，分为无功能性和功能性。此外，pNEN在生物学行为、治疗应答、预后等诸多方面均差异显著。近年来，pNEN 领域关注度较高、研究成果颇丰，推动着国内外指南、共识的快速更新。
1. 高通量检测技术在 pNEN 中的研究进展
以微阵列芯片、二代测序等技术为代表的高通量检测不仅是研究pNEN分子特征的重要平台，也为pNEN诊断与鉴别诊断、治疗选择与疗效评估、随访监测等临床实践提供了具有广阔前景的辅助手段。
1.1 基因组
1.1.1 基因变异
多发性内分泌肿瘤综合征1型（muliple endocrine neoplasla type 1MENI）等家族性综合征的发现是遗传变异导致pNEN发生的重要例证。利用测序技术分析MENI等致病基因的胚系变异对以pNEN为首发症状的病人具有重要筛选价值。2011年，Jiao 等3l对散发性pNET 进行全外显子测序（whole-exome seoenceingwES）分析联合Samge测序验证发现MEN/ 基因同样具有高频的体谓胞变异（44%）且里程碑式地揭示了43%的肿瘤存在染色质重塑复合物相关基因DLXXM7RX的互斥突变。此外，14%的pNET被检测出mTOR通路相关基因突变从遗传变异角度部分解释了既往报道中该通路分子大量异常表达的原因。Scara等*对102 例散发性pNEN进行全基因组测序《whd一gamane yguensm。WGS）不仅验证了上述研究结果还发现了D历PDC5失活突变，EWSR!基因融合等新的miTOR 通路活化机制。日前对高频突变的ATRX，QX，MEV八l-D-M）基因所遍碍的蛋自进行免疫润化染色可用于销助整别形态学区分国难的pNET和pNEC后者主要存在TP53和RB!基因突变。此外有研究显示携带上述A-D-M突变的pNET病人术后复发转移时间较野生型病人显著缩短提示其作为预后指标的潜在生物学价值。mIOR拇制剂依维莫司是进展期ET的主要配向药物RADIANT-3 Ⅱ期临床试验是示依维英司较安慰剂明显廷长pNET病人的无进展生存期但对总生存期影响并不显著表明获得性耐药可能削制了其临床疗效（~l。鉴于pNET中存在较高顿的mTOR通路抑制基因变异以突变为导向的配向道疗可能有利于更精准地筛选病人使治疗效益最大化9。
功能性肿瘤占 pNEN的10%-15%其中论大多数是胰岛素瘤。C。等4检测39例膜岛素瘤发现与无功能性肿瘤不同前者仅存在MEN（25%），ATRX（25%））的低频突变面DXX突变则未检测到。进一步通过wE联合Se和焦函酸测序验证发型3a的胰岛家瘤有在YV1基因（心CI113Gh官372R）的热点突变。且功能学研究提示该突变具有致癌性。一项来白高加常人群的47例膜岛素瘤测序结果显示13强的样本也存在谈热点突变。基于上述发现y/基因突变对于膜岛素瘤的诊断具有一定提示意义。此外作为mTOR通路配基因。mTOR抑制剂对于携带该突变的病人可能具有治疗价值。面其他功能性种瘤。如胃泌率瘤，胰高直携案瘤等因病例罕见，鲜有报道是影响pFN预后的重要危购因素，21%~80的病人就诊时即可发生远处转移一。Rov等时20例散发的无功能性 pNET转移灶进行WE发现40%的种瘤组织被检测出染色质重塑基因（sSETD2，ARID1A，CHD8，DVArT1）突变。且部分基因表达缺失与病人复发及生存时间呈显著负相关。笔者团队对转移性pNET研究发现ARIDIA在275%的原发灶和30%的转移灶中表达缺失，且这部分病人5年生存率明显降低提示染色质重塑基因可能具有抑制pNET转移的生物学功能。
1.1.2 基因剂量改变 除了飘动基因的突变外区域乃至染色体水平的大片断DNA增减同样在pNEN中具有重要意义。LaPmee等一发现散发作pNET中存在高相的非整倍体事件77%的肿瘤至少存在1条染色单体。进一步分析发现，10号染色体朝发杂合性缺失（bdhutwypay LOH）合并MEVI双等位基国突变失活的亚退病人预后明是差商11号染色体LOH合并MEV失活的病人则预后较好揭示了LOH相关的新致癌机制。Yam等0l对65例来白RADIANT-3临床试验的pNET进行wE联合配向测序分析发现染色体局灶的拷贝数变异（opy amder was∶mEim。CNV）事件少见>93%的样本存在全染色体或染色体臂水平的L0H与拷贝数扩增。此外，A-D-M基因突变与染色体不稳定性升高显著相关从基因功能角度推断可能存在因果关系。Hoe等叫利用wGSwE分析211例pNET的CVV图谱发现拷贝数扩增，缺失及正常的3种模式在无功能性pNET中均存在。且发生CNV的病人复发风险增高;膜岛素瘤则不同无明显拷贝数缺失事件发生面拷贝数正常的样本 yy!基因突变率升高。关于转移性pNETRny 等0增曾 报告73%的转移灶被检测出CDK.V2A基因的拷贝数缺失。Ba等调过单核苷酸多态性花片分析直径≤3 的pNET发现48个样本依据CNV可聚类为临床特征不同的亚组，频发拷贝数扩增，拷贝数正常的Lou及DAxX ATRX突变的病人肝转移发生率高达73%表明拷贝数检测对临床风险评估具有提示意义。
1.2 转录组
转录组水平检测是基因组改变的脸证与延伸。M。i∶与等通过微阵列芯片检测力2例pNEN发现，mTOR通路抑制基因TSC2，PTEN在多数原发灶中表达下调支持既往P3K/AkmTOR通路在pEN中活化的研究结论。此外与无功能性pNEN相比SSTR2在胰岛素瘤样本中表达是著降低表明后者可能对生长抑素类似物道疗反应不佳。Hagvik等l利用RNA测序（RNA 如qpemsim。RNAq）分析散发，无功能的pNEN 发现生物学行为调和（Ki-67<s%且无转移）和不良（Ki-67》9且同时性转移）的两个亚组存在309个编碍基因的差异表达上述基因主要调控泪胞周期和分化提示其对pNEN 发展的促进作用，面mTB通路相关基器在不同生物学行为腔端中的表达则未见差异。
非编碍RNA通常在转录后水平发挥调控作用pNEN 中非编碍RNA研究主要见于mimRNA。一项旱期基于芯片检测的报告是示miroRNA表达谱《mi-9%9%100 等）差异可用于pNEN与腺泡润胞癌的整别;m次8-20g在胰岛素瘤中特异性高表达∶参与PIEN调控的m次-2/表达与Ki-67指数，肝转移显著相关0I。Tharm等口检测754个miroRNA发现mi-210表达与转移事件相关;m次-193 在pNEN组织及血清中均表达升高提示其可作为潜在的诊断性标记物。Lee等评估mRNA-27等8个差异表达的micrN发度，m次N4-/9%与pEN我理学分携，植价裂像，K=-67指数显著相关且miRMA-19a高表达病人无病生存期及总生存期均显著缩短表明其可能具备预测预后的价值。
1.3 表观基因组
目前pNEN的表观造传研究主要集中于DNA甲基化修饰。一项基于80个静瘤相关基因的甲基化花片死究是示无功能性pEN，胰岛素耀和置泌素端各自具有特征性的DNA 甲基化图谱提示上述肿种瘤分子发病机制不同以及甲基化特征用于pNEN分型的潜在价值口。近素Tu为等一利用甲基化老片对无功修性NE进行全基因组检测发现MEN1综合征相关性pNET较散发性和VHL 综合征相关性病例存在更高的Cp心岛甲基化发生率。此外Coaman等曾分析MENI相关的无功能性pNEN发现肝转移病例的抑癌基因启动子区存在更多的甲基化事件。最近L业三等问分析84例散发性pNET发现不同甲基化模式分退间存在特征性基因突变，染色体缺失等变异事件提示表观遗传异常是pNEN发生以及异质性产生的重要原因。既往研究显示pNEN的高顿异常甲基化基因主要包括RASSF1，HC1，APC，CDKV2A，MGIT MLH1，LNE1 等且绝大数表现为甲基化水平升高问。值得注意的是行使移除鸟嘌呤上烷基功能的DNA损伤修复基因MGArT被认为具有化疗指导价值。因启动子区甲基化修饰面表达缺失的NEN 病例对替莫唑胺等烷化剂治疗的有效反应率更高。
1.4 循环游离DNARNA
液体活检技术在种瘤的诊断，监测等方面展现了良好的临床应用价值。2018年Boumx 等首次在转移性pNEN病人循环游离DNA中发现了种糊特异性基因变异。且变异等位基因频牢与染色体不稳定性随种瘤进展面增高表明基于游离DNA的液体活检对评估肿瘤负荷和动态路测种瘤发展具有潜在价值以。Mod等1 发现循环游离RNA中存在神经内分泌种瘤特异性转录本。且基于51个特征性基因的mRNA开发了新的PCR直浆活检被术（N可∶）。牙究证实。逐被术比护强标记物CA能更有效抱识别及预测 pNEN术后复发减。随着然来越多pNEN特征性分子事件被揭示新的液体活检策略将不断产生有助于pNEN临床诊治效果的提升。
高通量检测技术的普及与随之面来的数据积累，整合为深入了解pNEN分子特征搭建了高效的研究平台。然面受限于pFN的军见性及异质性其关键价子图谱远被完全认识。此外绝大多数基于组学的研究结果缺少生物学章义的间述和职证。
2. pNE模型研究进展
疾病模型是用于分子功能，机制及药物筛遗等临床前研究的重要工具。由干对pNN认识起形较晚，生物学行为相对惰性、临 床病例罕见等因素导致日前成熟的研究模型较其他常见种瘤明显置乏。
2.1 人源泪胞系
pNEN人源泪胞系数目十分有限常见的包括BON-1，QCP-1和CM。BON-1来源于分泌5-羟色胺的pNEN转移性淋巴结∶QG-1，CM分别来源于生长押瘤和预岛素瘤司。上述泪胞在依维莫司，生长抑素类似物等pNEN一线药物的初期疗效评估中发挥了重要作用。然商这些润胞系构建年代较为久远随着对pNEN认识的深入BON-1和QP-1国缺乏MEVI突变，SSTR低表达，增殖过快等因素代表性受到质疑。近来Beat等（利用胰岛素瘤病人的淋巴结构建了增殖活性相对低《Ki-67 15%~20%）的pNET泪胞系 NT-3提供了更接近临床实际的研究模型。随后Lmy等可在转录和蛋自水平对比分析B0N-1（P-1和NT-3的多肿神经内分泌，上皮标记物表达认为前两者具有分化好的神径内分泌表型可用于pNET基础研究。最近3D培养系统在pNEN研究中受到关注该系统能体现复杂的润胞问交互作用以及通过基质润胞共培养反映微环境对种瘤的影响较校常规2D培养更能复现pNEN的部分生物学特征0l。Apsil-Monm 等利用3D 系统或功将86%的pNEN 原代润胞培养或具有内分泌表型的膜岛样类种瘤组织并进行了舒尼替尼，依维英司，替英唑胺等常见药物的评估实验使其成为个体化药物筛遗的潜在平台。日前成熟的pNEN泪胞系均来白于功能性肿瘤占pNEN比重>60%的无功能性肿瘤尚缺乏代表性润胞系亟待解决。
2.2 人源异种移植PDX模型
泪胞系是种瘤研究中最常观，简便的模型但由于缺少完整微环境以及多次传代后可能出现的遗传变异。导致其难以模拟种糊的实际情况。人源异种移植（patiat-山riowdxaogafPDX）直接来源于新鲜润织很大配度上保阀了高代护端的特征是临床用药筛选的可靠工具。Chembrhin等叫对pNEN的 PDX研究发现几经传代该模型仍然维持pNEN的形态学特征及特异性基因突变和表达。进一些药物实脸是示，部分HDX 出现了临床常见的依维莫司耐药现象并发现新型mTOR 想制剂s取un有b对依维整司耐药护倒仍然产生治疗反应，体现了PDX良好的临床前蛋究价值。然面pEN的PDX模型构建工作却充满挑战。一项早期包含106例神授内分泌种瘤（eNEN8例）的PDX牙究发现，仅7例（eEN3 例）或功种植于小鼠且仅1例发生肝转移的担囊神径内分泌种瘤可持续传代C。同样Krmra等报道39例pNET 中仅1例成功构建出PDX模型。进一步分析发现肝谓胞生长因子酪氨酸激酶变体MET的激活是pNET泪胞能在免疫缺陷小鼠上生长的关键。pNEN则相对容易构建PDX 日前至少存在19种消化道pNEN的 PDX模型。可能由于pNE较为罕见且组织获取难度高相关报道少见。如何提高pNET建模咸功率以最大限度地发挥 PDX的临床转化效用值得深入研究。
2.3 基因工程小鼠动物模型
基因工程小鼠原位模型是日前种类最多的pNN研究树型。早在20世配80年代，文献【39-40】分别利用胰岛素和前胰高直糖案原基因启动子在个属胰岛β和a泪胞中表达SV40病毒大T抗原构建了胰岛素瘤（RIP-Tmg）和胰高血糖素瘤（Gh2-Te）的转基因模型。随着对pNEN分子特征认识的深入CaLbnr等首次报道通过全身杂合性敲除 Mm/基因构建了MENI综合征模型（Mm/）该模型小鼠在9~16个月龄可形成胰岛素瘤。此后该团队又借助ce-LP技术利用胰岛素基因启动子在β润胞条件性敲除 Mm/基因3-8号外是子构建了胰岛素瘤模型（Nm1-w）【4。有像的是基利用前胰高血糖素原启动子在a润胞敲除Mm1早期可形威胰高血糖素瘤，胰岛素瘤以及两者的混合瘤>12个月龄则几平均为胰岛素瘤推测a谓胞中Mm/缺失可产生分化转移这也许部分解释了功能性pNEN中瓶岛素熵占大多数的原因。近年来，K心avchi等利用既往C57B6I背景的BIP-Taug 小属与A背景个属杂交后获得了无功能性pNEN模型AB6目6%的个属发生杆物移，与嘴床实际吻合度较高。除上述几种主要个属模型外其他报道通过特异性基国启动子张合或单貌较人密基码（如cVhrAu/）皮敲入抑盛基因（如Pro）等构建了各具特征的pNN校型。基因工寻个鼠主要优势在于具备完善的免疫系统以及能连续观察病情进展但也存在建模时间长，花费大，或功率不稳定等缺陷。
2.4 类器官模型
类器官模型是干泪胞或器官特异性祖润胞在体外分化，增殖为与亲代器官在结构和功能上相似的复杂3D组织具有自我更新和自我组织的特性（l。近些年该模型因在再生医学、基因治疗、个体化药物治疗等领域应用前景广泛商成为研究热点。目前类器官在pNEN 中的研究鲜有报道。最近Kawa或等一利用新鲜临床样本构建了包含25个神经内分泌种瘤（1例pNET，2例pNE）的类器官库。进一步通过个鼠异体移植培养及多组学分析发现类器官模型与临床样本在组织病理学，功能学特征和遗传变异方削存在较高的相似性表明I有颞究个体静增生物学行为和评估特异性边疗策感的重要意义。然面对于分化好的种窟16例样本仅建功构建了3个类器宜构型，可见真正发摆嘴床实用价值还组经历很长的探索之路。
上述pNEN模型各具优势和不足应依据实际需要和科研条件选择最合适的帮究模型。道临床宝际面言，缺少酸发性，无功能的pET模型一定裂度上制约了pE基础研究以及临床诊行的进展。
3. 结语
近年来以二代测序为代表的高通量检测技术发展迅猛从基因组，转录组，表观基因组等多个水平揭示了pNEN的分子特征部分研究结果已经运用于临床诊疗工作转化意义显著。开发具有代表性的pNEN模型是推动整体研究进程的关键pNEN的泪胞系，PDX基因小鼠等传流研究模型种类在近些年得到扩充面以类器官为代表的新型pNEN模型也显示了其狼特的优势值得深入探索。然商pNEN 发病率低，异质性高的特点使其临床前研究工作在种增学馆域仍处干相对落后抱位。多中心药区境乃至国际化合作既是保证研究罕见病样本量的重要模式也为对比分析不同遗传背景eEN的特征搭建平台。随着牙究数据的快违职署逻级退化帮究亚型济有助干彩统全面抱认识时NEN的群体异质性。此外，利用单退胞测序等前沿技术手段从润胞水平嗣述pNEN的个体异质性可能会带表实繁性的进展。
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