研究药物骨毒性临床前评价方法和药物骨毒性临床前评价方法的进展
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2022-05-12
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【摘要】
骨骼是人体重要的系统，具有支持、保护、造血、维持矿物质平衡等功能，目前药物骨毒性问题已引起全球关注，其临床前评价非常重要。药物骨毒性临床前评价方法主要包括检测骨密度、骨组织形态学、骨强度和骨代谢指标等。Wnt/β-catenin、RANKL/RANKOPG和BMP-2/Smads等信号通路参与调控骨代谢过程，因此深入了解这些信号通路可为药物骨毒性临床前评价提供新的思路。
【关键词】
骨骼;药物评价，临床前;骨质疏松
骨由中胚层间充质干细胞增殖分化而来，具有支持躯体、保护体内重要器官、供肌肉附着、作运动杠杆、造血等作用。研究发现已上市药物中存在大量骨毒性风险药物，主要引起骨量减少、骨质疏松、骨代谢紊乱以及骨微结构受损等。糖皮质激素广泛用于治疗免疫性疾病、急性炎症、血液系统疾病等，但长期服用糖皮质激素，可导致患者骨质脆弱和骨骼再生能力受损。喹诺酮类药物是一类广谱抗菌药物，但动物实验证实喹诺酮类药物对各类幼龄动物的关节软骨均有毒性，这使得其在儿科的应用受到限制。
另外，有研究显示50% 以上服用抗癫痫药物的癫痫患者会发生骨骼形态异常、骨质疏松、骨代谢紊乱等不良反应。因此，需加强药物骨毒性临床前的评价工作，从而提高临床用药安全，目前已有许多国内外非临床安全性评价指导原则指出，当药物对人的骨结构或骨代谢产生不良反应时，需开展针对于骨毒性评价的临床前试验以解决上述担忧，但这些指导原则中并未详细描述骨毒性评价的指标及方法。此外，药物骨毒性的分子机制尚不明确，这也阻碍了药物骨毒性评价的进一步发展。因此，本文通过综述药物骨毒性临床前评价方法及其毒性机制的研究进展，以期为药物骨毒性评价提供参考。
药物骨毒性临床前评价方法
1骨密度（BMD）
检测 BMD是指单位体积或面积的骨矿含量，BMD降低是药物出现骨毒性的阳性指标，如噻唑烷二酮类药物、糖皮质激素、选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂、非甾体抗炎药等，同时 BMD 的降低也意味着骨量的减少，骨折风险的增加。目前 BMD 的检测方法众多，包括双能X射线骨密度吸收法（DXA）、定量计算机断层照相术、外周定量计算机断层照相术、定量超声 BMD测量术、微计算机断层扫描法（Micro-CT）等。其中 DXA被公认为诊断骨质疏松症的"金标准"。但 DXA 检测所得BMD为面积骨矿含量，只能得到二维骨微结构信息，易受到骨骼尺寸和周围软组织密度改变的影响。Micro-CT采用微焦点X射线球管，分辨率达微米级别，具有良好的显微作用，近年来广泛用于高分辨率的小动物骨骼成像，且检测的是骨松质 BMD，更能代表骨量变化、可作为临床前检测 BMD 的常用方法。
2 骨微结构损伤检测
2.1 骨组织病理学分析 骨组织病理学分析是评价骨微结构的常用方法，其中苏木精-伊红（HE）染色法是应用最广泛的方法。LIU等给予关节炎（OA）模型小鼠不同浓度的依托昔布（etoricoxib）进行为期 4周的治疗，采用HE 染色法检测胫骨内侧软骨、软骨下骨及滑膜组织的病理变化，结果显示，经依托昔布治疗后，OA小鼠胫骨内侧软骨下骨的空骨细胞/总骨细胞比率升高，提示依托昔布具有促进软骨下骨丢失、减少软骨下骨量的潜在风险。由于骨骼在 HE染色法中需要脱钙，这使得原有骨组织的边缘形态常发生改变，从而导致研究者无法准确评估骨微损伤状态。不脱钙硬包埋法和活体荧光标记法为其改良版方法，可通过测定不脱钙骨标本更好保留骨组织微结构，还可得出骨体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、厚度（Tb.Th）、分离度（Tb.Sp）及骨皮质厚度等参数值，定量反映骨微结构变化；同时采用活体四环素、钙黄绿素在骨重建过程进行荧光标记. 从而观察骨组织的变化并得到骨动态参数信息。
2.2 扫描及透射电子显微镜 扫描电子显微镜（SEM）是一种高分辨率的3D技术，可同时令骨细胞及其所在基质成像，具有制样简单、放大倍数高、图像分辨率高、景深大等特点20世纪70年代开始，SEM就已应用于骨微结构的检测中，目前采用SEM检测骨超微结构的技术已十分成熟。透射电子显微镜（TEM）可穿透骨组织样本，直接观察到骨胶原纤维、骨细胞形态及细胞内部构造，但骨骼切片样本必须非常薄（50~100mm），制样过程相对复杂。近年来，研究者常将两种电子显微镜联合使用，如PROKOPOWICZ等采用扫描透射电子显微镜（STEM）与SEM等方法探究在抗癌药物多柔比星应用下，一种有效的药物传递系统再羟基化类纤维（SBA-15-R）的骨矿化能力，于STEM和SEM镜下可观察到，SBA-15-R在模拟体液中浸泡7d后，其表面形成了富含钙的无定形磷酸钙层，且分别在14d 和21d后转变为羟基磷灰石和骨样羟基磷灰石，上述结果表明SBA-15-R具有骨矿化潜力。综上，电子显微镜凭借放大倍数大、分辨率高等特点在骨微结构评价中占有天然优势。
2.3 Micro-CT 除上文阐述的BMD检测，Micro-CT还可检测的指标有骨体积与骨表面积参数如骨体积（BV）、骨表面积（BS）、BV/TV和骨表面积体积比（BS/IV），骨小梁参数（Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp）和骨皮质参数等GOMES等采用Micro-CT评价阿仑膦酸钠（ALN）对雌激素缺乏大鼠辐照后骨微结构的影响。Micro-CT结果显示，经X射线照射7d后大鼠的后肢皮质骨厚度增加，照射30d后骨单位长度与Tb.N减少，Tb.Sp增加，而AIN可缓解X射线照射的有害作用，抑制Tb.Sp增加和Tb.N减少。ABU等*采用Mirco-CT评价抗抑郁药舍曲林（5mg·kg’·d/l，2周）对钛种植体骨折大鼠骨愈合的影响，结果显示舍曲林组大鼠较生理盐水组大鼠的BV/TV与Tb.N 显著下降、Tb.Sp显著增加（P<0.05），结合其他结果提示舍曲林能抑制该种植体的骨愈合能力。目前Micro-CT已成为评价小型动物骨标本和大型动物离体骨微结构的“金标准”。
2.4 核磁共振成像（MRI）技术 MRI具有无创伤、无电高招美，氧同时汉货当质臂部骨小意微结构的休点，已成为临床中评齿骨质慧塑骨析风险的重要方法（。GBENELD等（2早在 20世纪0年代就比较了X材线振形找术、CT 租MI评骨骨膜及应模式和渗造性皮质融坏、极蚀、扩作、连综性及骨的外钙化的情况，结是某求 M5唯一的缺点是教塑织钙化型度是感利。沉年毫，一种令段柜囊批都直饮亿（WB-A服》被广经院用于诊断实体箱、淋巴增图多发性骨髓制及机关药效评价。日有，随布高场刻场高场M园扫搞亿的日登菁及，大大减少了M园体素的大小利扫持时间.可戏彩的部位色从院和园关节访端发展别驳骨五端、酸情访端、限关节等全身骨雪. 研究者们不亿可运用MI对骨质纸松签患者的骨雪遗行全到研究，还可为抗骨质疏松钙物的数评骨与骨毒性风险讯齿括拱有利每助。
3 骨须度检测 骨强度指合理的骨力学幼构，包括骨的质量与散日两个方面到.可变用三点弯南法等方法∶遍过检测一系列的骨生物力学参数对动物的骨须变进行谓情，主购的检测推标有弹力模量、最大有氧、最大废力、融坏有载等=。KND等作报焙苯妥真、知巴喷丁及左乙控西担三种抗额糊衍物对大鼠骨强度，骨情刻骨代副的服响时，任日围置给子大跃苏妥系（2m租·kR入知巴喷丁（30或150mn·k局>左乙拉西担（50或20mr·kRλ连综12剧。对大息胶骨进行骨组织彩态学检查，对取骨剂酸情进行BD检测.为实用三点考断评估大窝酸情须度，检测拖标为最大载有量、断裂缆，弹力校量。结运紧常苯妥系组大鼠取情的最大负氧，断裂能、治力想量控自就顺阀大基是著下脉（P-0店》.这泰明菜妥系组大鼠的酚骨须度果著降低;到左乙挖N超如巴喷丁维大鼠的生物力学参散与它白对酮练大鼠相比无明某患异.包知巴酸丁维大鼠与白对颗组大鼠相比其BVTV第减小.ISn第增如.骨秘或标物减少。破骨解胞数量增知，结是表明长朝号露于知巴哟丁的大基可索有情W度刻BMD座低的风险。同柳，刻上述知巴隐丁维大鼠的情组的形态幼是类创，有研文报莲称在骨质延松大鼠悦型中.大鼠的BD 刺骨组够形态学参戴发生了某著变化，包彩用三点弯南法测授的骨力学参数却没有明紧变化，分析翠圆可能是电于三点考油法检测的是骨皮质的力学参数行性，耐措质疏松中发生客针零登竹松质切I.
4 臂代附相标检测
臂代融指标和扬评需代附调五报标、骨转化生物标老物（BTM入激素与解熟因子等。日有在临宋中主要用于骨代明核制的剂助断及相关药物的疗效系测。在临床有，骨代喇指努色可成为有利的骨毒性评你报标，其中BTM 改行异、快速、简怎的优点有别作为单感的骨毒性评骨指标用于物临床租骨毒性谓骨，其又分为形或标老物料骨喝标老物网大亮。
4.1 骨形成生物标老物 1型胺桨占骨有机基质含量的2%，当1型浆胺桨从或骨细离分纸到离外介是时，其河哥编图取基端租胞检行异性酶切下，即为1型浆胺桨N编角素（PEP》与1型桨胺桨C端稍票（PCPλ，除少量沉积在骨基质中，大部分进入血液精环.园戴 PEP剂PCP的含量升高能说明1系胺聚合减违率如快，骨形成活跃。其中PEP是国际骨质疏松基金会及实验室医学取合会推荐最较感的骨形成生物标老物。P服R\EDN等（=研灾了书马两平（下m·k*入网戊粮的（30m·k*入左乙控园坦（150 mR·b*》对正常剂去部集Wistar 大鼠胶骨骨第、腰推和股骨短编 BAD 和微结构的罗响，每日满胃治药，连综10周，检测大窝愈清中PDP的本平。结是某示，治子卡马西平与限酸钠的大款血清中的PDP水平按正需对朋组是著降低（P<Q0）授示这种物可能具却制大鼠骨形成的风险。骨钙素（α》由成骨润图合成与分泌. 是骨瑟质中最本育的丰胺旱汞白。当成骨鲜图分餐出 α后，大部分α测积在情基质中，小部分进入血葡环;当骨琴质序解时CC便进入愈附环中，故CC位能及映骨转状车。满性疏酸酶（ALP》分布于情、肝刻小弱等部他，故用以病骨形成状茶的粹异性利使。骨行异性减性动顺期（BUP》相对于从P的排异性更高，BUP能促进骨基质动沉积、加强骨基质矿化。
4.2 骨吸收标老物 抗酒石酸酸性疏酸酶（TRACP》是维一一种由武骨烟粕分德的情吸收标老物，此外，TACP 还存在于巨噪阔胞、血小板、江阔胞等。TJCP有肉种糖基化形式，即抗消石酸酸性动酸酶5∶（TRACP5a》抗消石酸酸性动酸酶 品（TBPACP-品>.TNCP-E 主要来象于数性巨顾细陷，TAGP5b主零毫象于酰情算离.故可监用TCP-a 了解不例理理条件下的生物伟臂代排供汉妇LO等-常胃给子维性SD大款雷公磨甲素15μF b*·d，连缘8周，按雷公第甲素对大息骨警的非响，采用MeroCT检测大鼠腰推BD 及骨卖构，房检测大款愈浆中TRACP-5b 剂OC水平，纳屋是称需公酶甲素组大鼠血浆的TR.AGP-5b水平与空自对秀随大鼠相比显著升高，面破骨细胞数量是著降每，结合 McpCT的结屋初步表明雷公哪甲素在一定程度上耳以抑制函骨烟粕形或，对骨素失具有保护作用破骨解胞分经的TRACP 和组织蛋自 K不亿破坏骨瑟质，还能砖坏成 1型胺腺的三螺跑结构，释放w基刻汉基癌营调食济中，惠 1型家院缸基幅匙刻购基编素（ND4与CTW λ其中CTXI是最触感的骨吸收生物标老物。戴外，Dpr与Fyr色是破骨细胞内解 1型胺脱纤维时的解产物，不液肝脏碎解直接排重于果中.园戴检测Dpyr与Pyr的样本为生物体的绿液。
药物骨毒性作用机制
1 Wnuβ-痊环蛋自（β-ctrrin）们号通路 Wnu β-aenin 信号通路是一个复杂的蛋白作用网络，研灾表明咳信号通路中 重us 基及其配体、β-catrnin、成骨行异性转录园子（Bur2》表迄与功能的改变，将影响成骨解胞的增殖、分化，能到影响情基质的彩或剂矿化。研灾某术Wnuβ-ctrrin 何号通商的许多基吸变州代聘核制有关，如在先天性因酷切断综合架（毒教股碳》泰者中发理Ea3基园突变. 在 XV型成骨不全架相早发性情质政松中发理Eai 基因突变这也为抗骨质疏松药物开发授情了新充点刻要路。如全球首款配向骨烫化盂白的人象化lnC2单克降抗体rersrur山.可通过阐断骨烫化蛋自LRP-5用（Wnt受体》着齐，餐进新骨形成为减少骨吸收，用于绝经后扫女及老年男性骨质疏松的第疗。β-utmnin是Wrf-aturin们号遍路的中心配石剂意要或分，其功窗缺失持金形响或骨烟彩的增殖、分化与或著，为座低款骨组离的端殖分化，使次级骨化中心彩成减授进到影响骨生长（。Bur2可诱导或骨烟陷分化为增如主或清或骨阁离款量，选到刺激 α、1型胺浆，骨检正白和医翠牌的移转录。MU等研究乙融噪酸（AZ》对为节货模型大鼠的韵疗作用及机制，癸用 Wexrnbldx法检测Wnu β-ctni 差齐关键成员的蛋白体平.纳吴表明AZ可序低都膜维帜中Wntl，β-cutrin，郭物基园（ceye>刻基质金属蛋白酶2（MEP9）等盂白水平，为授高糖翠合成酶激酶3β（GSK-第》的水平。副AZ与Wnufp-ctnin 避路颜活剂氧化蒙用，上述状况得列了渔转。
综上，Wran-trrin们号通路参与骨形成，测控骨代围达程，湿入了解压何号通路除了缆液增知研究都对于骨沥发育和骨稳态的了解，还有盟遍过骨雪发育异常停另频公新研物配5的潜在骨毒性。
2 核园子xB受体激测圆子配体（BANL》1枸圆子xB受体需化园子（RANK》1骨保护蛋白（OFG）销号通路 PNL假KCFG通路是肿削坏W页子团家练的一部分，存在于多种都官中。20其纪9 年代质实发理逐们号测高在调节骨重想，黄骨鲷离的形或与分化改及多种制理挖态中配看重要作用。BNK在破骨细陷有体表到高度表造.与BANKL结合后，能够餐进员骨细陷分化减著。RkL 由或骨润图产生，当粥酸依顿淋巴烟离激活为受明骨喝纹制酸时，破骨细熟利体报纹别RNK与BANK 的合们号，餐进武骨细胞有体深融骨细陷路分化。副CPG作为BANKL的绣饲受体，由骨基质细离相成骨解胞表选.可同止BANK 剂BANKL结合，ORG 不亿可同新歌骨烟陷分化，还策构制或著武骨解彩的存活及骨吸饮需性。由于这一符性，研究者们已u骨组期中或功分离路 CFG为或人壹简骨限护素用于绝经后扫女骨质跃松的的疗。另有研究表明. BNK0FG比例增高会餐进破骨细胞分化与骨丢失，罗响园索包括长朝服用糖业质激索，免疫抑制剂、辉激考缺乏剂杆候琴露于甲状劳零激素;服用每激素如师二醇、雷济着秀，琴露于鸡料木素以及增如械发变等情况低B测NKL0FG 比例（-l。R测NK1 BNKOFG遍路及其与多种细粕园子图钙调教素在调行劳骨酒狗形直中的机吃作用，为选一步了解骨是疾松、摩发性骨肿增塑约风湿关节数等骨代附核制的理生理学授情了标要路（4。日利针对滨们号路的研物如BANKL的单克抗体地渐单抗（derronrs）已被找用于的疗骨质政松安和错肿喘疾病=!
3 其物们号路 研窝表骨彩态发生戏白-2（BP-2）Ana何号通路模却制耳餐进骨烟彩亡，到在体内实验中发现中减药骨砥康能押制去和染大鼠骨润胞测亡，其主数通过上调 BP2、pSnad 残自p-Sasd5 蛋自，或骨相关转录园子抗体（cdurix》Bnr2表造. 加强BF26eat路的信号表i，为测过上调拉测亡蛋白，下调测亡灭白含景，从副规制组离%亡（一。另有要区表明骨质政松与糖果病存在的眼票可与p3挖裂桨活化蛋白激酶（p38AAPK》1试氧化物解体增殖活化受体y共酸活园子-1a（PCC-1a）1 葡鸟糖运蛋自 4（QUT）停号遍路有关-。戴外. 住有研文表明经典的粕外调节蛋白酸酶（EK），cJun 氨基米编激期（JNK）们号路色与骨钢钟害相式（1 总填 日稍高四尚关建文一套标准的伤物骨毒性档床耐评价方法.随着人用药品注册找术要求国际协调会（CH>关于骨质政松我物临床病评臂方法指导阳副的落地.从中可息EMID仍搭是评位有物骨毒性的理想报标;高低电子显费镜与各类形像学找术使骨组织私态学检测法授词了薏动发展;骨力学参数可补无 BD与骨组的零态学评特的不足;骨代围指努可便烧、灵较，快速地区映机体内骨代喇扰态，尤其是BTM.可挥助临床医生诊断骨代副校制为察测衍物疗资，钢息受调检测有法，亿系，人签的酸响、龙外，很入了解 Wr-atrin 刻B出NRAMK0FG节们号遍路.可从机制层到为预物情毒性评快授情更多的思路，为可遍过这些路中师常移预测畅衍的潜在骨毒副作用。综上;我们应对存在骨毒性潜在风险的药物概高警惕，关注巧物骨毒性临宋酮评骨方法，减少临床用产R患。
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