新型hbv相关肝细胞癌小鼠模型的构建及其免疫致病机理探究
发布时间：
2022-04-13
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慢性HBV感染是全球一大公共健康问题，全球约2.6亿的人口面临着因慢性HBV感染导致的肝炎，肝纤维化，肝硬化以及肝癌的威胁。虽然目前己经开发出了预防性疫苗，可以有效的降低HBV新发感染的几率，但是在低收入
国家预防性疫苗的普及率仍然很低。另外，针对慢性HBV病人尚未建立有效的治疗手段，通用的核昔类似物联合干扰素的治疗方法虽然可以有效地抑制病毒的复制，但是并不能彻底清除病毒，并且在停药后有明显的反弹现象，慢性HBV感染患者仍面临着发生肝癌的风险。因此，阐明慢性HBV感染导致肝癌发生的机制就尤为重要。HBV病毒可以通过宿主细胞基因整合而导致肝细胞中原癌基因的活化或者抑癌基因的失活进而导致细胞的恶性转化，同时机体免疫系统对被HBV感染的肝细胞的持续攻击会导致肝细胞的反复损伤和再生，免疫攻击也是致使肝细胞癌恶性转化的必要因素之一HBV抗原特异性的CD8+T对被感染的肝细胞的攻击是导致免疫损伤的最主要的因素，但是因为没有合适的动物型目前还没有对这一免疫损伤过程进行深入细致的研究。本研究主要通过利用肝细胞替代技术建立了一种构建HBV小鼠模型的方法，用于HBV的免疫损伤研究，并获得了以下几项结果:
1.利用肝细胞替代技术成功构建HBV相关肝癌小鼠模型。
首先通过肝脏灌流的方法分离了HBs转基因(HBs-Tg)小鼠和野生型(C57BL6/J)小鼠的肝实质细胞;然后使用脾内转输的方法把1.0X106肝实质细胞转输给8-12周龄免疫系统健全的Fah缺陷小鼠，进行肝细胞重建;撤去Fah缺陷小鼠的NTBC水供应，让受体小鼠肝实质细胞死亡，为供体小鼠肝细胞的生长提供空间。经过12周的肝细胞重建，我们可以成功构建HBs-Tg肝细胞取代小鼠(HBs-HepR)和其对照B6-HepRoHBs-HepR小鼠血清和组织中均可以检测到HBsAg表达。
2.肝脏取代重建的HBs-HepR小鼠表现出慢性肝炎，肝纤维化和肝癌。
相较于对照B6-HepR小鼠，当延长肝细胞的重建时间至18周后，HBs-HepR小鼠表现为ALT水平的升高，并在重建6个月后肝脏出现了纤维化。当重建到9个月后，所有的HBs-HepR小鼠肝脏中均出现肿瘤结节，经基因水平和组织水平的鉴定证实其为HCC，该HBV相关的HCC模型与己有的其他小鼠HCC模型不同，且与人HBV感染导致的HCC具有相同的分子表型。
3.抗原特异性CD8+T细胞在HBV相关肝细胞癌发生发展中发挥关键作用。
通过单细胞测序技术发现，在HBs-HepR小鼠肝脏中的CD8+T细胞发生了明显的活化，并且在免疫攻击的时间点有更多CD8+T细胞由naive表型向效应性表型转化。进一步我们通过流式细胞分析和免疫荧光检测验证了在HBs-HepR小鼠肝脏中存在HBsAg特异性CD8+T细胞，并且介导了肝细胞的凋亡。进一步通过抗体的清除和基因缺陷的方法，我们证明CD8+T细胞的缺失可以显著降低HCC的发生率。HBsAg致敏过的脾脏CD8+T细胞的回输可逆转HBs-HepR-CD8K0小鼠肝脏HCC的发生发展。
4.在HBs-HepR小鼠介导的损伤中B细胞，CD4+T细胞和NK细胞不起关键作用。
在HBs-HepR小鼠中不能产生针对HBsAg的抗体，甚至使用铝佐剂的HBsAg疫苗外周免疫攻击也不能产生Anti-HBs抗体，说明HBs-HepR小鼠的肝细胞损伤可能不是由B细胞产生的抗体导致的。
而使用抗体清除CD4+T细胞或者NK细胞后，HBs-HepR小鼠仍然全部会发生HCC，与未清除组小鼠相比没有明显的变化，说明CD4+T细胞与NK细胞在HCC的发生发展中不起重要作用。
5.在HBs-HepR成瘤小鼠肝脏中的T/NK细胞处于功能耗竭的状态。
使用单细胞测序技术发现在形成肿瘤的HBs-HepR小鼠肝脏中T细胞和NK细胞的功能性分子IFN-y等表达下降，同时利用流式细胞分析验证了这一现象。说明在发生肿瘤后，肿瘤微环境导致了肝脏内免疫细胞的功能耗竭促进了肿瘤的逃逸。
6.利用HBV全基因转基因小鼠来源的肝实质细胞亦可建立HBV小鼠模型。
当使用1.0x10“个C57BL/6J背景的HBV全基因转基因小鼠来源的肝细胞进行模型构建时，我们也可以成功构建肝细胞替代的HBV小鼠模型(HBV-HepR)，在受体小鼠Fah缺陷的小鼠体内可以检测到HBcAg阳性的肝细胞，并且在血清中可以检测到HBeAg}HBsAg以及HBV-DNA的表达。但是重建12个月后，的HBV-HepR小鼠模型并不会自发HCC.
关键词:乙型肝炎病毒，原发性肝细胞癌，抗原特异性CD8+T，慢性炎症，肝癌小鼠模型
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