阻断ERK途径有效地抑制光诱导661W小鼠视网膜感光细胞发生自噬应用与价值
发布时间：
2022-03-29
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前言
过强的光或长时间直视光源会对视网膜造成的一定程度的损害，称为视网膜光损伤。不同波长的光对视网膜组织的损伤机制不同，主要有热损伤、机械损伤和光化学损伤，其中光化学损伤是最常见的类型。特别随着手机、电脑等电子产品的广泛普及和眼科光学诊疗器械应用日渐增多，各种光源所致的视网膜损伤问题愈发引起人们的注意。此外，视网膜光损伤的病理过程与年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性等难治性眼底疾病有许多相似之处，视网膜光损伤会造成感光细胞的损伤、凋亡、生物膜溶解和细胞坏死，引发眼病，甚至导致视力丧失。目前对视网膜光损伤机制的探讨尚有待于进一步深入，而且至今尚无有效的治疗方法。
自噬是真核细胞生物一种保守的降解并回收胞质内蛋白质或受损细胞器的过程，自噬与凋亡相互作用，共同完成细胞程序性死亡的进程。自噬是否可以引起视网膜感光细胞的光损伤，其作用机制和途径如何，是本实验研究的着眼点。661W小鼠视网膜感光细胞是光感受器细胞很好的替代细胞，我们以661W小鼠视网膜感光细胞为实验动物模型，研究发现:2600Lux可见光照射可以诱导661W小鼠视网膜感光细胞发生自噬现象，而抑制自噬可以有效地保护661W小鼠视网膜感光细胞免受损害，E1ZK信号途径的活化是光致661W小鼠视网膜感光细胞死亡的关键。这些研究结论使我们对于视网膜光损伤相关疾病中感光细胞死亡的分子机制有了更为清晰的认识，为进一步寻求一种理想的治疗方法提供了新的思路。
摘要
抑制自噬在视网膜光感受器细胞光损伤中的保护作用自噬是一种保守的细胞自我退化的过程，在细胞生长关键时期如发育阶段或营养缺乏时常常对细胞发挥保护作用。然而，有时自噬也参与细胞凋亡进程。光感受器细胞是唯一直接暴露在光照下将光刺激转换为视觉信号的神经元细胞。但过强的光照射对视网膜仍具有细胞毒性作用。至今为止，视网膜光损伤的确切机制尚不明确，并且临床上仍无有效治疗方案，特别是自噬在光诱导感光细胞凋亡中的作用机制有待进一步探讨。
1.光照对诱导661W小鼠视网膜感光细胞产生自噬的作用
目的:
通过不同的自噬检测方法，观察2600Lux可见光照射对661W小鼠视网膜感光细胞自噬的影响。
方法:
(1)利用2600Lux可见光处理传代培养后的661W小鼠视网膜感光细胞株，建立光感受器细胞光损伤动物模型。
(2)利用western
blotting检测分析自噬标志性蛋白LC3在细胞中的表达水平，以及利用电子显微镜对自噬体形态学变化进行观察。
(3)应用3-MA和LY294002两种不同的自噬抑制剂对661W小鼠视网膜感光细胞进行预处理后，通过PI染色进行细胞死亡百分比定量评估，观察抑制自噬对661W小鼠视网膜感光细胞光损伤保护作用的影响。
结果
（1)在光强度26001ux照射1-2d的661 W
细胞中LC3II表达水平明显增强，实验组细胞中LC3II / LC3I的比例明显高于对照组细胞，其差异有统计学意义((P<0.001)。经过2天光照后，661W小鼠视网膜感光细胞表现出典型的自噬特性，一些胞内物质如细胞器被包绕在双层膜囊内，成为自噬小体。
(2)应用10 - 30}M的LY294002光照前30分钟对细胞进行预处理，细胞死亡比例从63%下降至20%,其最佳浓度在20}.M左右;661W小鼠视网膜感光细胞与2.5-7.SmM的3-MA预孵化，细胞死亡率从63%减少至30，在5 mM显示出最好的保护作用。
其差异有统计学意义((P<0.001)。结论:光照是诱导661W小鼠视网膜感光细胞发生自噬的关键，而且阻断自噬可以有效地保护感光细胞免受损害。
2. MAPK信号途径对光诱导661W小鼠视网膜感光细胞自噬的影响
目的:
研究在2600Lux可见光照射条件下，MAPK信号途径对661W小鼠视网膜感光细胞活性的影响，探讨自噬在光诱导感光细胞凋亡中的作用机制。
方法:
(1)利用2600Lux可见光处理传代培养后的661W小鼠视网膜感光细胞株，建立光感受器细胞光损伤模型。
（2)利用Western blotting检测ERKJ磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表达水平，通过PI染色对ERK抑制剂PD980519, JNK抑制剂SP600125和P38抑制剂SB203580预处理后的“1W细胞进行细胞死亡百分比定量评估。
(3)在指定时间内收集细胞裂解，利用Western blotting检测ERK和磷酸化ERK后LC3II和LC3I表达水平的变化，以及通过LysoTracker染色观察自噬小体内溶酶体生成情况。
结果：
（1)收集细胞裂解，对ERK/磷酸化ERK, JNK/磷酸化JNK, p38/磷酸化p38的表达水平进行蛋白免疫印迹分析，实验组(磷酸化组)扫描蛋白条带光密度测量强度明显增加，对照组(非磷酸化)只略有增加，其差异有统计学意义(P<0.001)。用40-80}.M的PD980519对细进行预处理，光诱导的细胞死亡比例从61%减少至约30 0，而SP600125或SB203580对细胞免受光损伤的保护作用效果不显著，差异有统计学意义(P<0.001) o
（2)通过Western blot检测发现，用40}M PD980519在光照30分钟前处理细胞，逆转了P-ERK和ERK的上调。定量分析结果表明，在PD980519预处理组非磷酸化和磷酸化形式的ERK水平均显著减少。而且光照2天后用40}.M PD980519处理组降低了LC3II/ LC3I比率的上调。通过Lyso Tracker染色发现:用40}MPD980519预处理即使在光照下也明显抑制了细胞溶酶体的形成。差异均具有统计学意义((P<0.001)。
结论:
可见光照射可以激活活化蛋白酶< MAPK)通路导致661W小鼠视网膜感光细胞发生自噬，在激活的MAPK信号下游通路中，是ERK通路而不是JNK或P-3 8在光诱导的细胞死亡机制中发挥了关键作用。通过阻断ERK途径能有效地抑制光诱导的661W小鼠视网膜感光细胞发生自噬。
本研究的发现可能在视网膜光损伤的治疗中具有潜在应用价值。
关键词:
视网膜光损伤，细胞自噬，神经保护，感光细胞，ERK
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