非常详细13步教你学会人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养

发布时间：

2022-02-15

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选材注意选取新生昆明小鼠（24h内）。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。

　　1. 将 15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液中储存。（注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过 6 小时，否则废弃）（推荐阅读：HUVEC-12人脐静脉内皮细胞、ECV-304人脐静脉内皮细胞、HUV-EC-C人脐静脉内皮细胞）
　　2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗 3-5 次，将污血冲洗干净为止。
　　3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入 15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化 15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
　　4. 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。
　　5. 将收集液离心（2000 转/ 分）3 分钟。
　　6. 倒去上清，加入 10ml M199 培养基（加入 10U/ml 的 bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。（注：每个培养瓶中加入 3- 4ml 无菌的 1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入 37℃孵育，最少 2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。）
　　7. 培养 24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉红细胞和死细胞，加入 10 ml 新鲜的 M199 培养基。
　　8. 以后每 2 天换一次培养基（每次换掉 2/3 的培养基）。
　　9. 一般培养 5-7 天，细胞可长满至 80-90%单层，这时可以传代。
　　10. 倒掉培养基，用无菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培养基终止反应。
　　11. 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个 50 ml 无菌离心管中，2000 转/ 分，离心 3 分钟。
　　12. 倒掉上清，加入 10ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶，以后照此传代培养。
　　13. 一般传代 2-3 代（培养了 20 天左右）用于做各种实验效果最好。