高糖介导的人主动脉平滑肌纽胞（HASMCs）功能改变在动脉粥样硬化中的作用及分子机制
发布时间：
2022-04-01
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研究背景
随着人们饮禽结构的改变和肥粹率的增加，糖尿病（diabetes，DM）的发病率日益端高。流行病学调查显示，糖尿病患者中动脉粥样硬化（mheroselerosis，AS〕的发生率和严重性选高于非糖尿病患者，而AS是冠心病等心血管疾病的主要病理基动，故深入研究精尿病加速AS 发生发展的具体机制，寻找有效的预防和治疗方法至关重要。（推荐阅读：HCASMC人冠状动脉平滑肌细胞）
正常血管壁中的平滑肌妇图（vasculur smoothmescle cells，VSMCs）只存在于均脉中限中，以收缝型为主，其增殖速度很慢。糖尿病状态下，高糖、活性氧等刺激损伤直管内皮。内度细胞、炎性组教和血小极等释放大慧生长因子和趋化因予，使 VSMCs 从生长羽制中御以释放∶同时上述细胞还能分泌大量基质金属蛋白酵（matrlx eetllogcoteinae，MPs》，后者催化组家外基质（extracellular marix，ECM）降解，促使 VSMCs从中膜迁移至内膜，迁移到内腹层的VSMCs可分滞多种粘附分子和趋化因子。促使单核巨啉细胞浸税和泡沫烟粗约形或。区面。VSMCs 增殖和迁移是糖尿病 AS斑块形成的中心环节。
组图周期作为增殖信号级联反应的题终途径。技各种有丝分裂刺激所共享。堆脓周期分为有丝分裂间期（G1 期、S期和 GZ期）和有丝分裂期（M期》，其中的各个检查点均有相应的报数周期蛋白（cyei）、润胞周期蛋白依粮性激酶（eyelin如opendent enes，CDK）及其为制剂（CDK inhibltot，cDK1）对其进行调控。直管损伤后，VSMCs响应有丝分裂原别藻从G1 期进入S期;其中oglinDI-GCDK4 和 cyeliE-CDK2 在这一特接期间按序发挥作用，是这一时期的细胞周期进穿所必需的，许多药剂，包括抗 VSMCs增殖剂，以及抗血栓和抗血小板剂。可以改变细腹周期中的一个或多个调节事件，导致纸数周期进程的阻断，从面抱制纽胞增殖。
多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly（ADP-ibos）polymerase，PARP）-1是 PARP 家练最主要的亚型.发并了90%的PARP活性，PARP-1通过值化白身和其他染色质相关蛋白的多聚二磷酸腺苷核糖（poly（ADP-ibosyl》atiom，PARyktion）化来修复DNA，此外;PARP-1涉及多种组图功能，包括基因转录调控，须胞原期进展、长往。能量代侧和细略迁移，精尿病状态下，氧化应激、更硝假站等损伤DNA，PARP-1能够识别DNA 单链或双链损伤并枝激话。先前一系列研究已证实 PARP-1在糖尿病心机病，肾病，视网膜病及神经系统损害中的重要作用，然前其在燥展病加速1管内增生中的作用为未耀明。
研究目的
1.观察高模制激对人主动脉平滑从纽胞（HASMCs）中PARP-1表达的影响∶
2.哥究PARP-1在高糖诱导的 HASMCs增殖和迁移中的作用;
3.研究 PARP-1在镜尿病血管内腺增生中的作用。
研究方法
1.HASMCs的培养及分姐
用含2%FBS的SMCM培养基对 HASMCs进行体外培养，置于s%CO2，37C 孵育箱。
分组一∶根据高糖不同喇潍时间选行分组∶0小时、24小时、72小时、5天;分租二，正常对阻坦（NC，5.5 mM葡萄糖）、高渗对围组 （0c，5.5 mM荒药糖-275 mM甘露醇》、高糖利意跟（HG，33 mM葡药精）、高糖+PARP-1 抑制剂组（HG+PJ34。3mM葡萄糖-5回MPJ34>∶刻滋 72小时后收集细胞和培养基。
2.HASMC 增殖检测
用Cell-LirEdU 方法检测组愿的增殖情况。
3.渣式迎屋术拾测
收集于预后的组脚，稳化丙啶（propldiumiodide，PI）染色，利用液式细愿父检测集教而期的变化。
4.HASMC。 迁移检测用Transwell 小室法构测纸家的迁移情况，
5. 明咬酶谢检测
用明胶酶盖法检测各组HASMC。上清浪中 MMP2和 MMP9约活性。
6.蛋白质印漆法《wtem Rm）
视取不同千预组HASMCs粉紧白，采用 Westem 围ot方检测PARP1、PAR、MMP2、MMP9及PCNA在蛋自水平的变化，以β-actin为内参照蛋白。
7.实验动物模型构建和组识获取
实验动物对象为C57BL%小限和C57BL6PARP-1基因敲除小鼠，均为8阀龄、增性、体重约25 g.将10只CS7BL6小蒙和10只CS7BL/PARP-1+小鼠腹腔注射链原佐剥素（septozotscin。STZ），剂量为5-gkg，另外 10只C9w作小以飘酸注射等法织的柠檬酸屋援冲液作为对州组。连续注射针s天。2 题后始测随机血精值，大于 16.7 mmol为1 型糖尿病造模成功，最终实验动特分沮如下;正管对围组，糖尿病CS7B16小属组、糖菜病 PARP-1小服近。遗模成功后，糖尿病和非糖尿病小鼠均行左侧颈总动脉结扎干术。术后3周取村。剥离整根主跳活包抵左侧硝总动警。放入5%名聚甲限中划使。液水准洗后进行石缝包埋和切片。
8.人体直置姐识获取和分组
与本隧移植中心合作，收集人体冠状动脑各分支。查看患者资料。排除悉性肿宿、急性炎控性疾病与风湿等氧统狭病患者的组织。临床直管标本获取后，迅迫放入49%多聚甲醛中，固定24小时后滤水冲洗过夜。初取左冠找动醚同旋支远段部分Smm段进行石的包坦称间片。是微像下观察，塑服庭管内费有于增生格组织分为正常组和增生组。
9.组织形态及免疫组织染色
对石短切片选行H&E到色，运围学疫组织化手验色法，粒测PARP-1.M0MP. MMP9 及增殖相胞核其原《proliferacing cell nuckear antign， PCNA）的表达水平，10.烧计学分析运用 SPSS v180软件进行数据分析。所有数据用均数生标准误 （MeansSEM）表示，采用Oneway ANOVA和Tuey post-hoc 方法进行分析，p值<0.05 时视为有统计学章义。
研究结果
1.高摘刺额促使 HASIMCs中 PARP-I 的表达增加
用高糖（33mM，HG）刺激HASMCs，Wesem Blot 检测发残 PARP-1 蛋白表达量于72小时达高峰。
2.高精潮意通过上调 PARP-1促进 HASMCz增殖
CcLightEdU 检测结果发现，与NC 组和 OC 组相比，HG 刺激显著提高了HASMC3对EdU韵摄取率;在HG环境下，加入PARP-1 抑制剂PJ4别很大程度的减低了EdU 摄取率。流式细激剂渐检测发现，与NC 组和 OC 组相比，HG GL 期细胞数目明显减少面S期图数目明暴增加∶PJ4是著辩制了HG诱导的GI-S慧较换，Wsr Blot结果提示，相比于与NC组和0C组∶HG组中PARP-1 活性产物PAR和 GI-5期较换的重要标志物 PCNA表达均明显上升，P4可是著抑制HG 诱导豹 PAR、PCNA 表达的增加。以上说明 HG 刺激可酒通过上调PARP-1的表达和活性，促进细胞 G1-S期转换，进而促进HASMCs增殖。
3.高糖刺数通汶上调PARP-1促进HASMGs迁移
Trarswell 细胞迁移实验结果表明，与 NC 姐和 OC 组相比。HG 组 HASMCs 的迁移显著提高;HG+PJ34组相比于HG粗组胞迁移率明显降低。Western Bkoat 和明胶酶谱检测结果显示，相比于 NC 组和 OC∶组。HG 组 MMP2 和 MMP9表达和活性是著提高;在HG环境下，加入PJ4可品著抑制MIMPs的表达和活性。
4.PARP-1促进糖尿病小藏在管内膜增生
1E 曼色结果呈示。与正常对照迅相比，精尿病Cs70L6小某预动脉内照用墨增厚∶糖尿病 PARP-!小家殖动脉内落及度相比于摘息病C57AL活小家明是菲宁。
免疫组化染色结果是示，与正常对阻坦相比，摘尿病 C57BL 小鼠颈动脉内膜明是增厚，其中 PARP-1、PCNA、MMP2和MIMP9的表达明显箱加∶相比于糖尿病 C57RL师 公鼠，糖探病 PARP-产小服烈动练内膜中 PCNA。MMPp 和MMP的表达明盟孩气，另务，我们用主动脉切片速行免烧组化警色，结要与硬动泳切片一致。
5.PARP-1在人招状动绿内服增生中的作用
与正常对理组组比，着生组内牌中 PARP-1、PONA、MMP塑MMP9 的表达明尿增加，与小佩实验结果一致。
研究结论
1.在高糖刺激下的 HASMCs和精压病血管中，PARP-1的表达上调。
2.PRP!请过保进性到G1S期转推;促进 HSMC1道看∶通过上请M0MP2. 9的表达和活性，促进 HASMSCs迁移。
3.糖城病今鼠体内。PARP-1上调可促进 VSMG增殖，丢移及内要埋厚。葱险PARP-1可有效料制工管内要建生，
关键词
PARP-1;鞭采病增殖∶迁移，内调滑生
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