BMSCs在视网膜脱离动物模型体内及低氧培养的661W小鼠视网膜感光细胞中所发挥的保护作用及其机制
发布时间：
2022-03-29
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661W小鼠视网膜感光细胞感光细胞损伤可发生于视网膜色素变性、视网膜脱离、视网膜光损伤、眼外伤等疾病中，其不可逆性损伤可导致视功能的严重受损，甚至导致盲的发生。其中视网膜脱离(retinal detachment, RD)是最常见的严重威胁视力的疾病之一，发生于视网膜全层裂孔、玻璃体视网膜牵拉或者视网膜下渗出等情况而导致视网膜神经上皮与色素上皮的分离，从而导致光感受器细胞失去代谢和营养支持而发生损伤。由于视网膜脱离过程中涉及到的光感受器细胞死亡受到多种信号途径相互作用影响，同时伴有胶质细胞增生、视网膜三级神经元激活及重塑等过程，因此单一针对某条通路展开治疗不能达到完全控制细胞凋亡并保持视网膜完整性的目的。
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在眼科多种疾病治疗中己开展了广泛的研究，如角膜缘干细胞缺乏、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、缺血及视神经损伤等，己被证实具有分化为神经样细胞、视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞的潜能，同时能够表达多种细胞因子及神经营养因子，同时抑制局部炎症反应改善视网膜微环境，减少视网膜细胞凋亡;修复RPE细胞，保护视网膜外屏障，并可能活化视网膜干细胞。
因此，本研究拟探讨BMSCs在视网膜脱离动物模型体内及低氧培养的视锥细胞系661w细胞中所发挥的保护作用及其机制。
方法
1.体外实验探讨BMSCs对661w细胞的保护作用及机制
(1)利用低氧培养法制备细胞损伤模型，观察细胞形态变化，MTT法检测低氧不同时长后细胞活力改变，同时利用AnnexinV-PI法、线粒体膜电位检测及caspase-3表达等方法检测细胞凋亡情况，利用Western blot、酸性囊泡标记物观察低氧后细胞自噬情况;同时低氧处理前1h加入自噬抑制剂3_MA，观察细胞活力、凋亡及自噬的变化;
(2)利用transwell培养体系将损伤的661w细胞与BMSCs共培养，同样方法检测细胞活力、凋亡情况及自噬情况改变。
2.体内研究分析BMSCs视网膜保护作用及机制
(1)分离获得BMSCs原代培养并进行鉴定;
(2)制备视网膜脱离大鼠模型，将培养的BMSCs移植入视网膜下，观察移植后视网膜复位时间段内多个时间点视网膜及BMSCs情况;以造模后未进行处理组及视网膜下注射PBS组为对照进行比较;
(3)初步检测BMSCs对视网膜的保护作用效果:组织切片及HE染色观察视网膜形态及外核层厚度，免疫荧光法及Western blot法检测视网膜光感受器细胞标记物Rhodopsin表达情况;
(4)研究BMSCs对视网膜保护作用的机制:利用TUNEL法计数视网膜内凋亡细胞数量，同时Western blot检测凋亡相关通路蛋白的表达情况;Westernblot法检测视网膜组织中自噬相关蛋白表达量;
(5 ) BMSCs在眼内情况:利用细胞标记试剂盒标记BMSCs后移植到RD模型视网膜下，免疫荧光法检测移植后的BMSCs在眼内移行及分化情况。
结果
1. 661w细胞低氧培养2h, 4h, 8h, 16h, 24h及48h后，细胞活力发生不同程度的降低，伴有细胞数量减少、凋亡数量增加及细胞形态异常，同时发现细胞自噬在低氧后开始增加，低氧8h时达到高峰后降低，利用3-MA抑制细胞自噬后细胞活力下降;
2.与BMSCs共培养的661w细胞形态较为正常，且活力有所增加，凋亡细胞明显减少，而共培养时加入自噬抑制剂，即使与BMSCs共培养，细胞活力仍发生降低的同时凋亡细胞增多;
3.移植BMSCs的视网膜脱离眼中，视网膜外核层厚度更接近正常视网膜，与空白组及对照相相比光感受器细胞较厚及排列较为规整;
4.移植BMSCs后，早期视网膜外核层内凋亡细胞数量明显减少，而且Caspase-3,8,9的表达量均较对照减少;
5.移植BMSCs后的短期内，视网膜LC-3II表达升高、P62表达降低，视网膜内自噬激活;
6.移植干细胞眼内没有观察到视网膜下移植的BMSCs有明显的移行整合过程及向视网膜细胞分化的倾向。
结论
本研究以BMSCs为研究对象，选择视网膜脱离及细胞低氧培养作为体内外实验模型，探索干细胞在其中发挥的保护作用及可能的部分机制。结果提示低氧环境对体外培养的光感受器细胞系661w细胞造成损伤，而早期自噬水平的提高有利于帮助细胞度过低氧应激，降低细胞凋亡，保护细胞活力;与BMSCs共培养能够降低低氧对661w的损伤，减少细胞凋亡，这种保护作用的发挥在一定程度上是由BMSCs介导的自噬调控实现的。视网膜脱离后视网膜细胞特别是光感受器细胞发生了包括凋亡、自噬、坏死、增殖等一系列病理变化，致使视网膜复位后仍存在光感受器细胞形态功能不能完全恢复;BMSCs眼内移植后能够明显减少光感受器细胞死亡，保存视网膜形态结构，其能够减少视网膜细胞凋亡，并在移植后短期内激活视网膜细胞自噬，帮助视网膜细胞度过视网膜脱离后的缺氧及低营养状态期。
本实验观察BMSCs在光感受器细胞损伤时发挥的保护作用的同时研究其发挥作用的机制，一方面可以通过抑制细胞凋亡来减少细胞损失，另一方面可以激活细胞自噬从使细胞在应激状态中存活。
关键词:
骨髓间充质干细胞，光感受器细胞损伤，视网膜脱离，低氧，凋亡，自噬
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