小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）详细到第个步骤注意事项，请收下
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2022-02-11
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1. 取小鼠股骨胫骨，小鼠要年轻！（6W-8W，以前用只一年左右的养出来外形也张牙舞爪，但流式检测没有CD11c表达，很奇怪啊；性别方面公母不限，经典版本说公的好，公的壮实，骨头大）。
2. 冲骨髓细胞，冲出来的骨髓细胞永远没有文献上说的那样多，但不影响大局，一次用两只，怕出意外少了细胞，不要混一起。
3. 细胞计数，不去红细胞！（不知是好是坏，文献说去红细胞会把一些祖细胞也去掉了）记数，计数只记白细胞（形态学区分，红细胞无核较小），2×10e6（似乎太低，这套方案作者是一皿养到第12天的，所以个人觉得看在哪天收细胞做下游实验，如果只养到第6天或者第8天，多点应该也行吧？）白细胞种100 mm细菌培养皿（注意是细菌培养皿，说悬浮细胞还是用细菌皿好，还说抑制细胞贴壁，让更多祖细胞向树突细胞分化而不是巨噬细胞），这一天记为第0天。
4. 第3天加等体积（10 ml）BMDC培养基
配方：每50 ml含：1640基础培养基45 ml，5 ml灭活胎牛血清，50 ul 100×的β-巯基乙醇（一直不知道它的作用，请高手跳出来作答谢谢啊），500 ul 100×的谷氨酸盐，1 ug rmGM-CSF（Chemicon和PPT的都用过，现在用PPT，好像还行）。
5. 第6天，第8天半量换液，离心设置为300 g，5min（不知道够不够，肯定有损失）。
6. 第10天300 g，5min收集悬浮细胞转到细胞培养皿（巨噬细胞多贴点壁），同时培养基成分里rmGM-CSF含量至少减半。
7. 第11天加LPS刺激其成熟，普遍认为，第6天或第8天收不成熟DC会比较多，看实验需要，建议想要不成熟DC的朋友请在这两天收网。
一般做到第5步就上流式，也就是6到8天的BMDC, CD11c表达波动在50－80％，偶尔做CD86，成熟标志吧？15％左右。具体流式结果和光镜形态照片过几天（或几周）发上来大家一起探讨。MHC2没有做（技术员说实验室流式机器做APC的有关部件有故障，MHC2抗体正好带APC）。还发现用PE标记和FITC标记的CD11c流式抗体检测CD11c表达发现阳性细胞数（还是表达量）相差1倍（同一批细胞分两管，分开操作，抗体剂量不同，都过量了，都洗了两遍，一个公司的抗体，25％和50％）。
总结：
1. 培养100％纯的DC几乎是不可能，一般达到85％就不错了，在收集细胞是只要吹打不要太猛，巨噬细胞一般是不会悬浮起来的。
2. 有时也几只小鼠的骨髓细胞混养，但只要是同系（如：都是C57）的，问题不大。
3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓细胞混养就不可避免地产生混合淋巴细胞培养。
4. 骨髓细胞中有淋巴细胞，两个个体的细胞混合会产生“混合淋巴细胞培养”反应，导致淋巴细胞大量增殖
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